細胞轉染：瞬時轉染和穩(wěn)定轉染及轉染效率影響因素

真核蛋白表達細胞轉染方式有兩種：瞬時轉染和穩(wěn)定轉染，本文的主要介紹了兩者的定義和適用性及細胞轉染一般步驟，影響轉染效率的因素，幫助我們提高實驗的成功率。

在哺乳動物細胞蛋白表達實驗，根據不同的實驗目的，將質粒導入細胞有兩種方法：瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。細胞轉染是將外源基因導入真核細胞的過程。質粒、DNA、RNA將這些外源基因導入到真核細胞內并不容易，要跨越細胞膜的屏障進入細胞質。

瞬時轉染

瞬時轉染是指外源基因導入到細胞后得以表達，但是基因不整合到細胞的基因組上，因此不會隨著細胞的生長復制。因此，瞬時轉染的時間有限，通常只持續(xù)幾天，直到外源基因在細胞生長分裂過程中因各種因素消失為止。判斷細胞是否轉染成功，在構建質粒上含有報告基團，以指示目標基因是否存在，一般在轉染兩天后即能被檢測到。

穩(wěn)定轉染

穩(wěn)定轉染是在瞬時轉染的基礎上，瞬時轉染時有一小部分的基因會整合到細胞基因組上，并隨著細胞的生長分裂，質粒會隨機分配到子細胞中從而稀釋直終丟失，所以穩(wěn)定轉染要進行穩(wěn)定細胞系的篩選，經過篩選出來的細胞株，此時的質粒已經*整合到細胞基因組中，隨著細胞的生長復制并穩(wěn)定的遺傳給后代。

瞬轉穩(wěn)轉適用性

瞬時轉染表達和穩(wěn)定轉染表達顯著的區(qū)別就是在時間上。瞬時轉染在轉染后四天即能收獲細胞，瞬時轉染一般用于基因產物的短期表達、基因敲除、蛋白質的小規(guī)模合成。相對于瞬時轉染，穩(wěn)定轉染表達適用于長期的藥理學研究遺傳調控機制研究及大規(guī)模的蛋白質合成，需要大量的周期，因此更費力成本投入高。目前，在進行哺乳動物細胞蛋白表達蛋白時，因為細胞培養(yǎng)技術的進步和人們對瞬時轉染的不斷探索，人們已經可以對一些常用細胞進行懸浮培養(yǎng)，實現了瞬時轉染對重組蛋白的大規(guī)模合成，節(jié)省了時間和成本。

細胞轉染一般步驟

以24孔板進行細胞瞬時轉染表達為例，全程操作均為無菌狀態(tài)，以免造成細胞污染

1）轉染前準備，細胞株或者直接培養(yǎng)后的細胞用胰蛋白酶消化后計數，鋪板，培養(yǎng)基為含有1ml血清，不含抗性的正常培養(yǎng)基。

2）針對每孔細胞，用50-100ul無血清培養(yǎng)基稀釋0.8-1.6ug的質粒，并混勻

3）針對每孔細胞，用50-100ul無血清培養(yǎng)基稀釋4ul左右的轉染試劑，混勻室溫防止5min

4）將第二第三步的溶液混勻室溫防止20-30min

5）用PBS沖洗細胞，在用無血清培養(yǎng)基沖洗細胞，在加入0.5ml的無血清培養(yǎng)基

6）將四步驟得到的混合物加入到每孔中，輕搖混勻后放入37℃，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-6h

7）將無血清培養(yǎng)基換為血清培養(yǎng)基（10%胎牛血清）孵育24-96h后檢測結果。穩(wěn)定表達，在轉染24h后傳代新鮮培養(yǎng)液中，48h后加入抗性，穩(wěn)定表達需要數周時間。

哺乳動物細胞瞬時轉染流程圖

影響轉染效率因素

1. 轉染試劑

瞬時轉染和穩(wěn)定轉染可以選擇不同的轉染試劑，轉染試劑的選擇又可以根據已經發(fā)表的文獻。已經有很多細胞株被成功轉染，通過文獻資料可以參考適的轉染試劑，當然也要根據不同的實驗需求選擇。此外，不同的轉染方法也要選擇不同的試劑，一般要求是轉染試劑要低毒，高效，廉價易得。

2. 轉染方法

轉染方法分為兩類：瞬時轉染和穩(wěn)定轉染。轉染方法的選擇對轉染結果影響也很大，。根據細胞的性質及不同的操作手法，摸索轉染條件。瞬時轉染和穩(wěn)定轉染都需要優(yōu)化DNA 與轉染試劑比例， 細胞培養(yǎng)及檢測時間。一些傳統的轉染技術，如磷酸鈣法，電穿孔法，脂質體轉染法都各有利弊，關于各種轉染方法的比較和原理，可參見細胞培養(yǎng)方法的比較。

3. 細胞狀態(tài)

一般傳代數小于50代以下的細胞即能保證基因型不變。瞬時轉染合適的細胞是達到對數生長期的細胞，此時細胞生長旺盛，容易被轉染。同一種系的細胞株，在不同實驗室不同培養(yǎng)條件下，其生物學性狀都會產生不同改變，從而導致其轉染特性也發(fā)生變化。因此，針對這種轉染效率降低的情況，應轉用新鮮培養(yǎng)的細胞轉染達到好的結果。

4. 載體構建

基因產物對細胞不能有毒害作用，瞬時轉染難以進行。轉染載體的構建選擇可調控，強度合適的啟動子很重要，可以做空載體或相同載體的其他基因為對照排除毒性對細胞的影響。 病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細胞周期，如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞。

5. 其他要求

（1）細胞培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是瞬時轉染的基本要素。不同細胞選擇不同的培養(yǎng)基，血清和其他添加物。使用的轉染試劑要參考其說明書。培養(yǎng)物一定要避免細菌，支原體真菌的污染。

（2）血清

血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的成分不明確添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質量的變化直接影響細胞生長，因此也會影響細胞轉染效率，不同批次購買的血清質量也會存在差別。對于傳統的轉染方法要求在無血清培養(yǎng)基條件下轉染，血清被認為會降低瞬時轉染的效率。針對現有人們常用的的轉染試劑來說，血清的存在已不會影響轉染效率，甚還有助于提高轉染效率。在轉染過程中*可以使用血清，針對RNA 轉染，消除血清中潛在的核糖核酸酶污染要格外關注。且血清比較珍貴，胎牛血清，馬或牛血清都常被用到，價格也不盡相同，根據自身選擇。

（3）細胞密度

細胞密度對轉染效率也有一定影響，一般轉染時貼壁細胞密度為50-90%，具體要根據選用的轉染試劑的說明書。不同的轉染試劑適的細胞密度各不相同，即使同一種試劑，也會因不同的細胞類型或應用而異。

例如陽離子脂質體具有微量的細胞毒性而要更高的細胞鋪板密度或更多的懸浮細胞數， 盡量在細胞適的生理狀態(tài)下轉染，以求好的轉染效果。

（4）DNA 質量

針對一般常用的轉染技術都是基于電荷吸引的原理轉染的，如果DNA的純度不高，存在其他雜質，如鹽離子等都會影響轉染復合物的形成。針對市面上現有的超純質粒抽提的試劑盒，能達到非常高的純度效果，從而可以避免DNA純度的影響。