qPCR實(shí)驗(yàn)常見問題及解決方法

一、擴(kuò)增曲線不穩(wěn)定

可能原因

RNA純度低；體系中存在較多雜質(zhì)；儀器使用時(shí)間過長(zhǎng)。

解決方案

1）提取高純度的RNA，小心操作。

2）對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。

二、擴(kuò)增無法達(dá)到平臺(tái)期

可能原因

模板濃度太低；循環(huán)數(shù)太少；試劑擴(kuò)增效率低。

解決方案

1) 提高模板量

2) 提高循環(huán)數(shù)

3) 用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定擴(kuò)增效率，提高鎂離子濃度，換用擴(kuò)增效率高的試劑。

三、熒光下降

可能原因

存在降解；模板濃度過高。

解決方案

1) 提高體系純度

2) 降低模板量

3) 降低熒光閾值

四、單峰、峰不尖銳

可能原因

與試劑成分有關(guān)；或存在大小相近的非特異性擴(kuò)增。

解決方案

1) 溫度跨度不高于7度，視為可用結(jié)果

2) 進(jìn)行高濃度瓊脂糖電泳，確認(rèn)是否為單一條帶。

五、單峰，Tm低于80度

可能原因

只有引物二聚體，無目的條帶；或擴(kuò)增片段過短。

解決方案

1) 檢查是否加入模板

2) 進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，確定條帶大小是否正確

六、雙峰，較低峰Tm在80度之前

可能原因

由于模板濃度過低或引物濃度過高使多余引物形成引物二聚體。

解決方案

1) 適當(dāng)提高退火溫度

2) 提高模板量，降低引物濃度

3) 重新設(shè)計(jì)引物。

七、qPCR注意事項(xiàng)

·提高樣品純度，盡量減少樣品之間的交叉污染。

·每個(gè)樣品至少要做3個(gè)平行孔，以防在 后面的數(shù)據(jù)分析中，由于Ct相差較多或者SD太大，無法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

·MasterMix不要反復(fù)凍融，如果經(jīng)常使用，最好融解后放 在4℃；配置體系時(shí)在冰上操作；減少加樣誤差，每管或每孔都要換新槍頭，不要連續(xù)用同一個(gè)槍頭加樣；所有成分加完后，離心去除氣泡。

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