離子交換層析實(shí)驗(yàn)（IEC）原理、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

原理

離子交換層析（IEC）用于蛋白質(zhì)分離的原理的是基于帶相反電荷分子間的相互吸引力，其中蛋白質(zhì)表面所帶的電荷取決于蛋白質(zhì) pI 和環(huán)境 pH。蛋白質(zhì)的保留時(shí)間和鹽濃度決定了其與基質(zhì)表面相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量。一般在低鹽濃度時(shí)使蛋白質(zhì)結(jié)合，而在高鹽濃度時(shí)洗脫蛋白質(zhì)。等度洗脫的洗脫窗口很低，因此通常以線性鹽濃度梯度洗脫蛋白質(zhì)。

用途

根據(jù)蛋白質(zhì)表面電荷的不同，分離純化目的蛋白。

材料與儀器

試劑：氯化鈉溶液、平衡緩沖液（20mMTris，pH8.0）、洗脫緩沖液（20mMTris+1MNaCL，pH8.0）、SDS-PAGE

材料：層析柱、色譜填料

儀器：pH 計(jì)、勻質(zhì)機(jī)、離心機(jī)、蛋白純化儀

步驟

一、IEX 分離

將 IEX 介質(zhì)填充到柱中以形成填充床，然后用填充基質(zhì)孔隙和顆粒之間空間的緩沖液平衡床。

二、平衡

1、將固定相平衡到所需的起始條件：當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，所有固定相帶電基團(tuán)都與可交換的反離子（例如Na+ 或 Cl-）結(jié)合。

2、選擇起始緩沖液的 pH 值和離子強(qiáng)度，以確保在上樣時(shí)，介質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，盡量避免與雜質(zhì)結(jié)合。

三、上樣和清洗

1、結(jié)合目標(biāo)分子：樣品緩沖液應(yīng)具有與起始緩沖液相同的 pH 值和離子強(qiáng)度，以結(jié)合所有帶電靶蛋白。帶相反電荷的蛋白質(zhì)與 IEX 介質(zhì)的離子基團(tuán)結(jié)合，集中在色譜柱上。

2、洗掉所有未結(jié)合的材料：不帶電荷的蛋白質(zhì)或與離子基團(tuán)具有相同電荷的蛋白質(zhì)以與緩沖液流速相同的速度通過色譜柱，在上樣期間或之后洗脫，具體取決于上樣的總體積。

四、洗脫

當(dāng)所有樣品都已上樣并用起始緩沖液清洗柱子以使所有未結(jié)合的蛋白質(zhì)都通過柱子時(shí)，改變條件以洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。最常見的是，通過增加緩沖液的離子強(qiáng)度（鹽濃度）或偶爾通過改變 pH 值來洗脫蛋白質(zhì)。

注意事項(xiàng)

1、蛋白質(zhì)在低鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應(yīng)先評(píng)估蛋白質(zhì)復(fù)合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、離子交換劑的選擇

必須根據(jù)各類離子交換劑的性質(zhì)以及待分離物質(zhì)的理化性質(zhì)，選擇一種較為理想的離子交換劑進(jìn)行層析分離。選擇離子交換劑的一般原則如下:

① 選擇陰離子或陽離子交換劑，決定于被分離物質(zhì)所帶的電荷性質(zhì)。如果被分離物質(zhì)帶正電荷，應(yīng)選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電荷，應(yīng)選擇陰離子交換劑；如被分離物為兩性離子，則一般應(yīng)根據(jù)其在穩(wěn)定性質(zhì)來選擇交換劑的種類。

蛋白質(zhì)屬于兩性電解質(zhì)，所帶電荷取決于所處緩沖液的 pH 大小。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)等電點(diǎn)大于其所在緩沖液 pH 時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，應(yīng)選用陽離子交換劑；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)等電點(diǎn)小于其所在緩沖液，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，應(yīng)選用陰離子交換劑。

② 強(qiáng)型離子交換劑適用的 pH 范圍很廣，所以常用它來制備去離子水和分離一些在pH 過高/過低的溶液中解離且較穩(wěn)定的物質(zhì)。弱型離子交換劑適用的 pH 范圍狹窄，在 pH 為中性的溶液中交換容量高，用它分離生命大分子物質(zhì)時(shí)，其活性不易喪失。

強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂雖然可與很多陽離子交換，但對(duì)正電荷的膠體和高分子陽離子都不易吸附或吸附很少，所以一般用弱酸性樹脂分離堿性蛋白質(zhì)。強(qiáng)、弱型離子交換劑的交換容量與適用 pH 范圍的比較。

③ 離子交換劑處于電中性時(shí)常帶有一定的反離子，使用時(shí)選擇何種離子交換劑，取決于交換劑對(duì)各種反離子的結(jié)合力。為了提高交換容量，一般應(yīng)選擇結(jié)合力較小的反離子。據(jù)此，強(qiáng)酸型和強(qiáng)堿型離子交換劑應(yīng)分別選擇 H 型和 OH 型；弱酸型和弱堿型交換劑應(yīng)分別選擇 Na 型和 Cl 型。

④ 交換劑的基質(zhì)是疏水性還是親水性，對(duì)被分離物質(zhì)有不同的作用性質(zhì)，如吸附、分子篩、離子或非離子的作用力等。

常見問題

1、蛋白質(zhì)在低鹽濃度下可能發(fā)生沉淀，所以，在選擇鹽溶液之前，應(yīng)先評(píng)估蛋白質(zhì)復(fù)合物在給定鹽溶液中的溶解性。

2、緩沖液的 pH 對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)合于 IEX 吸附劑的影響并呈一般性的趨勢(shì)，可以影響相互作用的強(qiáng)度。選擇緩沖液的 pH，應(yīng)該確保蛋白質(zhì)和吸附劑在該環(huán)境下能夠穩(wěn)定(如避免使用pH過高/過低的溶液)。

3、可加少量還原劑或者去污劑防止蛋白聚集。

4、蛋白高鹽洗脫后盡快換至穩(wěn)定緩沖液中。

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