Protein A/G 親和層析法純化單克隆抗體原理、步驟及注意事項

簡介

目前約 70％ ~ 80％ 的抗體純化使用 Protein A/G 親和層析法。Protein A 與 IgG 的結(jié)合強度很大程度上依賴于該抗體的種屬和亞類，而 Protein G 對于大多數(shù)哺乳動物的 IgG 則有著更高的親和力，因此，Protein G 可用于純化不能與 Protein A 很好結(jié)合的哺乳動物單抗或多抗 IgG 的純化。

原理

Protein A/G 親和層析法純化單克隆抗體的基本原理是 Protein A/G 能特異性地與抗體的 Fc 段結(jié)合，因此 Protein A/G 親和層析柱可用于抗體（單抗和多抗）的分離純化，具有很高的選擇性。經(jīng)過一步親和層析，即可從腹水、雜交瘤培養(yǎng)上清或免疫血清等樣品中得到高純度（＞ 95％）的抗體。

材料與儀器

器材：

Protein A/G 親和層析柱，FPLC 層析系統(tǒng)

試劑：

上樣緩沖液：0.02 mol/L PBS，pH 7.4

洗脫液：pH 3.0~4.0、0.02 mol/L 檸檬酸緩沖液或 pH 3.0、0.2 mol/L 甘氨酸 -HCL 緩沖液

再生液：0.1 mol/L 乙酸

步驟

Protein A/G 親和層析法純化單克隆抗體的基本過程可分為如下幾步：

A. 樣品預(yù)處理：小鼠腹水于 4 ℃、12000 r/min 離心 15 分鐘，以除去較大的凝塊。經(jīng)上樣緩沖液倍比稀釋后，0.45 μm 濾膜過濾。

B. 平衡：以 1 mL/min 的流速，用 5-10 倍層析柱體積的上樣緩沖液平衡層析柱，至流出液 pH 值為 7.4。

C. 上樣：預(yù)處理過的腹水上層析柱，保持 1 mL/min 流速，繼續(xù)用上樣緩沖液流洗 5～10 倍層析柱體積至基線穩(wěn)定（即雜蛋白wan全洗脫）。

D. 洗脫：用洗脫液洗脫柱結(jié)合抗體，同時應(yīng)用 FPLC 層析系統(tǒng)進(jìn)行實時監(jiān)測，當(dāng)觀察到基線開始上升，即出現(xiàn)洗脫峰時，每管 3 mL 收集流出液，直至洗脫峰回到基線，并立即用 1.0 mol/L pH 9.0 的 Tris-HCL 緩液調(diào)整收集的各管流出液 pH 值至 7.0。

E. 再生：保持 1 mL/min 流速，用 3～5 倍層析柱體積的再生液淋洗柱子。

F. 平衡：繼續(xù)用 5～10 倍層析柱體積的上樣緩沖液重新平衡層析柱，至流出液的 pH 呈中性，再用 10 倍層析柱體積的三蒸水平衡，可重復(fù)使用。
G. 濃縮：合并調(diào)至中性的各管洗脫液，采用超濾離心管進(jìn)行濃縮，最后以 0.15 mol/L PBS（pH 7.4）調(diào)整到合適體積，進(jìn)行 SDS-PAGE 鑒定純度，BCA 法進(jìn)行抗體定量，分裝凍存。

注意事項

1. 純化前所有緩沖液、樣品及層析柱都必須平衡至室溫，以避免產(chǎn)生氣泡。

2. 純化前樣品、緩沖液須用 0.45 μm 濾膜過濾去除顆粒性物質(zhì)，以防層析柱被堵塞而降低純化效果。

3. 使用經(jīng)飽和硫酸銨粗純的樣品不僅可獲得更好的純化效果，還可適當(dāng)延長親和層析柱的使用壽命。

4. 加樣后，讓樣品在親和柱內(nèi)滯留一定時間（約 30 分鐘）可提高親和柱的純化效率。

5. 在酸性條件下洗脫的抗體必須立即中和到中性（pH 7.0 左右），以利于維持抗體的生物學(xué)活性，避免抗體失活。

6. 在使用和保存層析柱時，應(yīng)避免柱內(nèi)液體流干，以防氣泡進(jìn)入。

7. 為確保層析柱的使用壽命和載量，及時清洗非常重要，清洗完成后用上樣緩沖液重新平衡。

8. 層析柱可于 4 ℃、20％ 乙醇中長期保存。

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